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【干貨分享】第四期：PCR結(jié)果分析，自動基線也別用啦

基線是指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即所謂的基線（如圖1）。

2022-02-21


上期干貨分享，淘氣的小編留了一手，其實調(diào)節(jié)閾值線在ABI7500上還有更快捷的方法，只要在曲線圖下方把“Auto”取消，再點擊勾選Show：Threshold就可以啦?。ㄈ缦聢D所示）

細(xì)心的你可能發(fā)現(xiàn)，除了Threshold（閾值線），還有Auto Baseline（自動基線）。在通常情況下，PCR實驗結(jié)束，閾值線和基線都是默認(rèn)為“Auto”的，今天，我們就來聊一聊什么是基線？取消自動基線，如何調(diào)節(jié)基線范圍？以及，基線調(diào)節(jié)和閾值線調(diào)節(jié)是怎樣配合分析PCR結(jié)果的？
　1. 什么是基線？　

基線是指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即所謂的基線（如圖1）。
基線范圍的設(shè)置是同步設(shè)置的，即不管一個實驗數(shù)據(jù)里面有多少擴增曲線和通道，以及各曲線指數(shù)增長期的起始位置，以ABI7500為例，該儀器一般默認(rèn)的起始和終止循環(huán)數(shù)為3~15個循環(huán)（如圖2）。
圖 1

圖 2



2. 儀器自動基線與手動基線會呈現(xiàn)怎樣不同的結(jié)果？

情況一：你是否也遇到過這樣擴增曲線，如圖3所示，機器自動基線設(shè)置的太寬，就會導(dǎo)致基線下傾的現(xiàn)象。

圖 3

導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因就是機器自動基線設(shè)置的太寬導(dǎo)致的，標(biāo)本在15個循環(huán)之前就進(jìn)入指數(shù)增長期，而機器自動基線固定的把指數(shù)增長期作為基線，就導(dǎo)致此種曲線的出現(xiàn)，只需手動把基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長期之前即可，比如將此數(shù)據(jù)的起止循環(huán)數(shù)調(diào)整為3-8個循環(huán)數(shù)后，擴增曲線就恢復(fù)正常了，如圖4所示：

圖 4


情況二：基線不平，不僅可能存在的弱陽性曲線“被淹沒”，還導(dǎo)致閾值線“無從安放”，如圖5所示：

圖 5

此時，只需手動把基線的起止循環(huán)數(shù)調(diào)整到合適位置即可，比如，把圖5的起止循環(huán)數(shù)改為10-20個循環(huán)后，基線就會變平整，閾值線也不再“無從安放”，如圖6所示：

圖 6


情況三：實驗中常見的氣泡干擾實驗結(jié)果分析，如圖7所示：

圖 7

氣泡導(dǎo)致的折線，不僅影響閾值線調(diào)節(jié)的準(zhǔn)確性，更會影響結(jié)果的判讀。這種情況怎么調(diào)整基線呢？很簡單，只需把基線的起始循環(huán)數(shù)設(shè)置在氣泡出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)后即可。比如，圖7中的2個孔位氣泡破裂的循環(huán)數(shù)為11、14，我們將起止循環(huán)數(shù)設(shè)置為15-20后，即可恢復(fù)正常，如圖8所示：

圖 8

此時調(diào)節(jié)閾值線，會更容易判斷閾值線應(yīng)該處于什么位置（可以參考上一篇干貨——調(diào)節(jié)閾值線），從而得到更準(zhǔn)確的Ct值。



3. 如何手動調(diào)節(jié)基線？

文章開頭介紹了在ABI7500上調(diào)節(jié)手動基線的快捷方法；而根據(jù)儀器的區(qū)別，調(diào)節(jié)基線的方式也會有所區(qū)別。一般來說，調(diào)節(jié)基線的位置都會在“Analysis”→ “Analysis Settings”這樣的菜單欄選項中，取消所有的“Auto…”，輸入合適的基線范圍，再“Apply”即可。不知道多少合適？沒關(guān)系，多調(diào)試幾個基線的范圍就可以調(diào)整出既美觀又準(zhǔn)確的基線了。


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