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【干貨分享】第五期：數(shù)字PCR知多少
在PCR擴增階段，數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平，再平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應(yīng)。
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在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digital PCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估算起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別：定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出原始拷貝數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。
在PCR擴增階段，數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平，再平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應(yīng)。與qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法不同，數(shù)字PCR是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集，有熒光信號記為1，無熒光信號記為0，有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝。
數(shù)字PCR原理示意圖
由于dPCR是一種終端分析法，如果目標(biāo)分子沒有很好的離散化，如一些小室在結(jié)束時具有不止一個的靶標(biāo)，那么理論上結(jié)果得到的濃度可能就會棄之不用，這就是泊松統(tǒng)計發(fā)揮作用的地方。采用泊松概率分布公式(Poisson distribution)進行計算，根據(jù)數(shù)字PCR反應(yīng)單元總數(shù)和有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋倍系數(shù),就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度)。
1999年，Vogelstein和Kinzler首次提出了數(shù)字PCR概念。2006年，F(xiàn)luidigm公司推出了第一臺基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)，而后QuantaLife又利用油包水微滴生成技術(shù)開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)。在QuantaLife公司被Bio-Rad公司收購后，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀。2013年，該公司又推出了升級型號QX200。
利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，該微滴是數(shù)字PCR的樣品分散載體；PCR反應(yīng)結(jié)束后再利用檢測儀器檢測每個微滴的熒光信號。大量的微滴提供了足夠的精確度，能準(zhǔn)確測定拷貝數(shù)狀態(tài)。微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）的出現(xiàn)使得數(shù)字PCR的靈敏度上升到了新的臺階。
目前，數(shù)字PCR在液體活檢中具有廣泛的應(yīng)用，包括基因表達差異化研究、基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)研究等。其在低濃度和低豐度病原體中的絕對定量、無標(biāo)準(zhǔn)品病原體絕對定量中的應(yīng)用也逐漸凸顯，特別是隨著新冠疫情的發(fā)展，對于低拷貝數(shù)樣本的檢測逐漸成為了研究熱點與關(guān)注焦點。
伯杰醫(yī)療始終堅持創(chuàng)新，致力于成為真正的“病原體診斷專家”。目前，伯杰技術(shù)服務(wù)部已推出新型冠狀病毒、流感病毒、諾如病毒等病原體數(shù)字PCR檢測服務(wù)。
該項服務(wù)基于伯杰醫(yī)療近期引進的法國stilla數(shù)字PCR儀，儀器采用最新的油包水微滴生成技術(shù)，靈敏度可達0.2拷貝/uL；同時，該數(shù)字PCR平臺將結(jié)合伯杰先進的測序技術(shù)，更深入地在呼吸道病原體檢測領(lǐng)域譜寫新篇章！
上海伯杰醫(yī)療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應(yīng)用，深耕于多重?zé)晒?PCR 診斷試劑和痕量病毒二代測序試劑及相關(guān)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線，從診斷試劑、診斷儀器、測序服務(wù)和醫(yī)檢所服務(wù)等多個面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng)新，質(zhì)量為先”的方針，為醫(yī)療機構(gòu)、疾控公衛(wèi)、高?？蒲械群献骰锇樘峁﹥?yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。
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