學(xué)術(shù)分享

集高靈敏度、快速、高特異性于一身的qPCR，是分子診斷學(xué)最常用的一種方法；然而，大家常常會被它的異常曲線所困擾。比如，某個通道所有陰性樣本的擴增曲線都向下傾（如下圖）。今天，伯杰技術(shù)就與您分享導(dǎo)致這種“怪異曲線”的原因及解決方案。

原因分析

這種怪異曲線下傾的根本原因是qPCR儀矯正過度導(dǎo)致的，熒光的發(fā)射光譜是一個拋物線，常見的熒光物質(zhì)FAM、 VIC、 ROX的發(fā)射光譜之間存在交叉（如下圖），qPCR 儀通過計算減去因交叉誤讀的信號，常見的計算方法是：A 通道計算得到的信號（FA）= A通道檢測的信號– B通道檢測的信號*K，這個的K是機器預(yù)設(shè)的固定參數(shù)；有時，B通道串到A通道的實際信號的比值要小于固定參數(shù)K，設(shè)備在計算時就導(dǎo)致了A 通道擴增曲線向下傾斜的情況。

舉個例子，在FAM通道檢測的信號中，假設(shè)機器預(yù)設(shè)ROX通道串到FAM 通道的K=20%，但是實際上串到FAM 通道的ROX信號只占ROX通道檢測信號的10%；而機器在計算時，只會按照預(yù)設(shè)的固定參數(shù)K=20%進行計算，即，F(xiàn)AM通道每次都會多減去10% ROX通道的檢測信號。隨著擴增ROX通道信號越來越大，F(xiàn)AM通道多減去的信號也越來越大，若此時FAM 通道是陰性樣本，就導(dǎo)致擴增曲線傾斜的更嚴(yán)重。

解決方法

2、點擊”Plate” → “Advanced Setup”，關(guān)閉其他通道，如下圖所示：

3、點擊”Results”，回到結(jié)果分析界面，然后，點擊“Analyze”重新分析即可，如下圖所示：

看，重新分析后的曲線，是不是清爽許多？回到了原來那熟悉的樣子

（本文以ABI Q5儀器為例，其他機型如遇該問題，也可使用該方法調(diào)整、分析）