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耀杰不凡丨第一刊:ddPCR比拼RT-PCR,探最精準(zhǔn)新冠載量變化

疫情之下,逆行者最美,守護(hù)人民健康,貢獻(xiàn)智慧與光芒,國(guó)內(nèi)首批獲證新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒知名生產(chǎn)廠家伯杰醫(yī)療特發(fā)起《“耀杰不凡”——致敬幕后抗疫英雄系列》學(xué)術(shù)專題活動(dòng)。

2022-02-21

“耀杰不凡”致敬幕后抗疫英雄推文解讀活動(dòng)


第一刊:ddPCR比拼RT-PCR,探最精準(zhǔn)新冠載量變化

疫情之下,逆行者最美,守護(hù)人民健康,貢獻(xiàn)智慧與光芒,國(guó)內(nèi)首批獲證新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒知名生產(chǎn)廠家伯杰醫(yī)療特發(fā)起《“耀杰不凡”——致敬幕后抗疫英雄系列》學(xué)術(shù)專題活動(dòng)。旨在傳播、分享疫情期間一線檢驗(yàn)及臨床工作者相關(guān)研究成果,經(jīng)過(guò)論文征集及篩查,最終確定病毒載量、婦兒感染、混合感染、病毒結(jié)構(gòu)、樣本差異、輸入防控、出院復(fù)陽(yáng)、試劑盒優(yōu)劣等8期內(nèi)容進(jìn)行分享。


本期研究主題:SARS-CoV-2感染者的定量檢測(cè)及病毒載量分析

本期研究由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院張福杰教授團(tuán)隊(duì)基于清華大學(xué)郭永研究員團(tuán)隊(duì)的微液滴數(shù)字PCR(ddPCR)研究完成,通過(guò)對(duì)比ddPCR和RT-PCR技術(shù)在新冠患者疾病進(jìn)展中病毒載量的變化,發(fā)現(xiàn)并證明了使用RT-PCR和ddPCR定量檢測(cè)下的病毒載量對(duì)于評(píng)估疾病的進(jìn)展有積極作用,而在病毒載量低的情況下,其優(yōu)勢(shì)更是顯著。

本期作者團(tuán)隊(duì)之一來(lái)自北京地壇醫(yī)院,他們?cè)谡麄€(gè)疫情期間,救治了大量的新冠患者,在北京防疫期間承擔(dān)著非常重要的工作,而這項(xiàng)研究成果也誕生在這個(gè)時(shí)期。

研究過(guò)程:

研究共納入了127例患者的400個(gè)樣本,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院張福杰教授團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)郭永研究員團(tuán)隊(duì)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)之初,為了達(dá)到更好的對(duì)比評(píng)估效果,不僅使用RT-PCR和ddPCR同時(shí)去檢測(cè)標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)所招募的127名受試者也既包括確診病例54例、疑似病例39例,同時(shí)又納入了34例因發(fā)燒或呼吸道癥狀接收篩查但不符合可疑病例診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者?;颊甙ǎ壕哂?次接觸史及2種臨床情況;無(wú)明確的接觸史,但符合3種臨床情況。(臨床情況包含:發(fā)燒和/或呼吸道癥狀,病毒性肺炎的影像學(xué)特征,發(fā)病初期較早的白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?;虻?,淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少)

圖1. 項(xiàng)目檢測(cè)參與者構(gòu)成圖



SARS-CoV-2檢測(cè):

本次研究所涉及的樣本類型較為全面,包括了口咽拭子,鼻咽拭子,痰液,血液和尿液樣本,統(tǒng)一采用專業(yè)的核酸提取試劑盒在2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成核酸提取,然后再進(jìn)行RT-PCR和ddPCR檢測(cè)。


其中RT-PCR檢測(cè)使用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司的反應(yīng)和擴(kuò)增系統(tǒng),對(duì)靶向ORF1ab和N基因以及陽(yáng)性參考的引物和探針進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄PCR。


檢測(cè)結(jié)果:

數(shù)據(jù)分析:通過(guò)RT-PCR和ddPCR兩種方法的檢測(cè),34例篩查病例和17例可疑病例的77份標(biāo)本結(jié)果均呈陰性。從患者年齡上看,中位年齡為40歲,男性比例為50%;入院時(shí)最常見(jiàn)的體征和癥狀是發(fā)燒和咳嗽。


從病程進(jìn)展看,77.6%的患者為輕度類型,而22.4%的患者為較嚴(yán)重類型。從臨床階段而言,有49例患者處于恢復(fù)階段,所占比例最大,其次是進(jìn)行性階段,早期階段和臨床治愈階段。7名患者的胸部影像學(xué)正常,因此處于不確定的階段。從癥狀發(fā)作到發(fā)病初期,進(jìn)展階段和恢復(fù)階段的平均天數(shù)分別為疾病發(fā)作后的4天,12天和20天。

圖2. 最終確診患者的癥狀


兩種檢測(cè)方法對(duì)另外76名確診患者的323個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果則顯示:根據(jù)RT-PCR結(jié)果,95例陽(yáng)性,67例單基因陽(yáng)性,161例陰性。95例陽(yáng)性的ddPCR結(jié)果也均為陽(yáng)性,RT-PCR的Ct值與病毒載量高度相關(guān)。在67個(gè)單基因陽(yáng)性樣品中,ddPCR陰性的有26個(gè),陽(yáng)性的有41個(gè)陽(yáng)性,拷貝數(shù)范圍為11.1至123.2拷貝/測(cè)試。


剩余161個(gè)RT-PCR陰性樣本中,有157個(gè)樣本的ddPCR檢測(cè)結(jié)果為陰性,4個(gè)樣本陽(yáng)性。結(jié)果表明,RT-PCR和ddPCR在高病毒載量樣品和陰性樣品中均準(zhǔn)確可靠。然后,我們進(jìn)一步比較了3個(gè)呼吸道樣本中的病毒載量。痰液中的平均病毒載量(17429±6920拷貝/測(cè)試)顯著高于口咽拭子和鼻咽拭子。

圖3. RT-PCR和ddPCR的樣本結(jié)果


結(jié)論:

此次研究表明,RT-PCR和ddPCR對(duì)高病毒載量樣品給出了一致的結(jié)果。不同樣本類型的病毒載量顯示,痰液樣本中的病毒比口咽拭子和鼻咽拭子要多。痰液樣本的定量結(jié)果與最近報(bào)道的研究一致:病毒載量在早期和進(jìn)行性階段呈現(xiàn)增加趨勢(shì),而在恢復(fù)階段則出現(xiàn)下降。恢復(fù)的患者可能會(huì)出現(xiàn)間歇性病毒脫落,導(dǎo)致核酸結(jié)果再次呈陽(yáng)性。隨著時(shí)間的流逝,大量患者將進(jìn)入康復(fù)階段并出院,對(duì)低病毒載量的監(jiān)測(cè)將更加頻繁。下呼吸道樣品的多次測(cè)試以及通過(guò)不同方法進(jìn)行的測(cè)試會(huì)很有助于提高敏感性并評(píng)估是否符合出院標(biāo)準(zhǔn)。

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